Mariotto svolse la sua prima attività artistica presso la contessa Alfonsina Orsini, moglie di Piero II de' Medici e madre del duca di Urbino, Lorenzo. Quando i Medici furono costretti a lasciare Firenze, l'artista riprese con ritmo più sostenuto la collaborazione con Baccio della Porta, già iniziata nel 1490-91 e poi interrotta nel 93, "affaticatosi intorno al naturale et a imitar le cose di Baccio, onde in pochi anni si fece un diligente e pratico maestro. Perché prese tanto animo, vedendo riuscir sì bene le cose sue che, imitando la maniera e l'andar del compagno, era da molti presa la mano di Mariotto per quella del frate".

I dipinti realizzati in collaborazione con Baccio includono la "Sacra Famiglia" (attualmente custodita nel LACMA di Los Angeles) e l'Annunciazione del 1497 per il Duomo di Volterra, ove si evidenziano gli influssi del Ghirlandaio, del Perugino, di Leonardo e, solo per l'aspetto della paesistica, quelli dei pittori nordici. All'Albertinelli viene assegnata la piena autografia del trittico della "Madonna col Bambino, angeli e santi" custodito nel Musée des Beaux–Arts di Chartres, ove risaltano i singolari anacronismi trecenteschi, e della "Madonna col Bambino e le sante ...." del Museo Poldi Pezzoli di Milano.

Il 26 luglio del 1500 il collega Baccio si fece frate, lasciando di colpo la bottega e tutto il lavoro ancora incompiuto – in quel periodo stavano realizzando l'affresco del "Giudizio Finale" – nelle mani dell'Albertinelli che  "per il compagno perduto, era quasi smarrito e fuor di se stesso", al punto che, continua il Vasari, se non avesse visto con tanto astio i religiosi del convento di S. Marco e in modo particolare il loro priore, il Savonarola, si sarebbe fatto frate anch'egli: "avrebbe l'amore di Baccio operato talmente, che a forza nel convento medesimo col suo compagno si sarebbe incapucciato egli ancora".

L'anno successivo Gerozzo Dini, il committente del già citato "Giudizio Finale" (attualmente custodito "staccato" nel Museo di San Marco a Firenze), volle in tutti i modi, avendo già saldato il conto, che Mariotto portasse a termine l'affresco lasciato incompiuto: "all'opra diede fine; dove con diligenza e con amore condusse il resto dell'opera, talmente che molti, non lo sapendo, pensano che d'una sola mano ella sia lavorata. Per il che tal cosa gli diede grandissimo credito nell'arte".

Il meraviglioso cromatismo della "Visitazione" del 1503 (Uffizi, Firenze) è certamente influenzato dallo spirito di Fra' Bartolomeo, ma vi non mancano riferimenti al Perugino, soprattutto nella rappresentazione dell'architettura e nelle stesse tonalità calde. Tutto il contesto compositivo del dipinto rappresenta, per l'arte fiorentina del nuovo secolo, una straordinaria spinta propulsiva. Alla visitazione si contrappongono invece, configurandosi come un ritorno al Quattrocento, la "Madonna in trono col Bambino e i santi Giuliano, Domenico, Nicola e Girolamo" realizzata nel 1510 (attualmente nella Galleria dell'Accademia a Firenze).

L'artista svolse la sua attività anche alla Certosa di Firenze realizzando, nella Sala capitolare, una "Crocifissione con la Madonna, santa Maria Maddalena e angeli", di cui il Vasari descriveva come "opera lavorata in fresco e con diligenza e con amore assai ben condotta. Ma, non parendo che i frati del mangiare a lor modo li trattassero, alcuni suoi giovani, che seco imparavano l'arte, non lo sapendo Mariotto, avevano contrafatto la chiave di quelle finestre onde si porge a' frati la pietanza, la quale risponde in camera loro; et alcune volte secretamente quando a uno e quando a uno altro rubavano il mangiare. Fu molto romore di questa cosa tra' frati: perché delle cose della gola si risentono così bene come gli altri; ma, facendo ciò i garzoni con molta destrezza et essendo tenuti buone persone, incolpavano coloro alcuni frati che per odio l'un dell'altro il facessero; dove la cosa pur si scoperse un giorno. Per che i frati, acciò che il lavoro si finisse, raddoppiarono la pietanza a Mariotto et a' suoi garzoni, i quali con allegrezza e risa finirono quella opera."

Nel 1505 l'Albertini si unì in matrimonio con Antonia Ugolini, figlia di un venditore di vini.

Nel 1506 iniziò la realizzazione di un' "Annunciazione", portata a termine soltanto nel 1510, commissionata dalla Congregazione di San Zanobi (attualmente custodita nella Galleria dell'Accademia di Firenze): trattasi della prima pala rinascimentale ove si evidenzia una Gloria dei Cieli inserita entro un volume di una struttura architettonica, la cui vitalità viene conferita dalla vigorosa articolazione delle gamme cromatiche, soprattutto quelle relative al chiaroscuro, ove la luminosità è una reazione alla sintesi operata nel frattempo dal "frate collega", che in tal periodo stava integrando la propria coloristica con quella dei pittori veneti e di Leonardo. Il Vasari evidenziava, a suo modo, le innovazioni della composizione: "prese a fare nella Compagnia di San Zanobi, allato alla canonica di Santa Maria del Fiore, una tavola della Nunziata e quella con molta fatica condusse. Aveva fatto far lumi a posta, et in su l'opera la volle lavorare, per potere condurre le vedute che alte e lontane erano abbagliate, diminuire e crescere a suo modo. Eragli entrato in fantasia che le pitture che non avevano rilievo e forza et insieme anche dolcezza, non fussino da tenere in pregio; e perché conosceva che elle non si potevon fare uscir del piano senza ombre le quali, avendo troppa oscurità, restano coperte e, se son dolci, non hanno forza, egli arebbe voluto aggiungere con la dolcezza un certo modo di lavorare che l'arte fino allora non gli pareva che avesse fatto a suo modo; onde, perché se gli porse occasione in questa opera di ciò fare, si mise a far perciò fatiche straordinarie, le quali si conoscono in uno Dio Padre che è in aria, et in alcuni putti che son molto rilevati dalla tavola per uno campo scuro d'una prospettiva che egli vi fece col cielo d'una volta intagliata a mezza botte, che girando gli archi di quella e diminuendo le linee al punto, va di maniera in dentro che pare di rilievo; oltra che vi sono alcuni Angeli che volano spargendo fiori, molto graziosi." "Questa opera fu disfatta e rifatta da Mariotto, innanzi che la conducesse al suo fine, più volte; scambiando ora il colorito o più chiaro, o più scuro e talora più vivace et acceso et ora meno; ma non si satisfacendo a suo modo, né gli parendo avere agiunto con la mano ai pensieri dell'intelletto arebbe voluto trovare un bianco che fusse stato più fiero della biacca: dove egli si mise a purgarla per poter lumeggiare in su i maggior chiari a modo suo; nientedimeno, conosciuto non poter far quello con l'arte che comprende in sé l'ingegno et intelligenzia umana, si contentò di quello che avea fatto, poi che non agiugneva a quel che non si poteva fare; e ne conseguì fra gli artefici di questa opera lode et onore, con credere ancora di cavarne per mezzo di queste fatiche da è padroni molto più utile che non fece, intravenendo discordia fra quegli che la facevano fare e Mariotto. Ma Pietro Perugino, allora vecchio, Ridolfo Ghirlandaio e Francesco Granacci la stimarono e d'accordo il prezzo di essa opera insieme acconciarono."

Nel 1509 anche il priore del convento ove operava Fra' Bartolomeo vide di buon occhio una nuova collaborazione fra i due artisti, con spese e ricavi equamente ripartiti. Da allora i dipinti di Albertinelli evidenziano nuovamente l'influsso del frate e, di conseguenza, quello luministico leonardesco.

Nel 1510 realizzò, per le monache di San Giuliano di Firenze, la pala d’altare – "Madonna in trono col Bambino e i santi Giuliano, Domenico, Nicola e Girolamo" già sopra citata – e la Trinità, entrambe custodite nella Galleria dell'Accademia a Firenze.

Da documentazioni certe risulta che la collaborazione con il frate finì il 5 gennaio 1513: il Vasari scriveva che Mariotto "persona inquietissima e carnale nelle cose d'amore e di buon tempo nelle cose del vivere; per che, venendogli in odio le sofisticherie e gli stillamenti di cervello della pittura, et essendo spesso dalle lingue de' pittori morso, come è continua usanza in loro, e per eredità mantenuta, si risolvette darsi a più bassa e meno faticosa e più allegra arte; et aperto una bellissima osteria fuor della porta San Gallo et al ponte Vecchio al Drago una taverna et osteria fece quella molti mesi, dicendo che aveva presa un'arte la quale era senza muscoli, scorti, prospettive e, quel ch'importa più, senza biasmo, e che quella che aveva lasciata era contraria a questa; perché imitava la carne et il sangue, e questa faceva il sangue e la carne, e che quivi ogn'ora si sentiva, avendo buon vino, lodare, et a quella ogni giorno si sentiva biasimare."

Nonostante tutto egli ritornò quasi subito all'attività artistica, ma le piccole composizioni realizzate nel periodo 1513 – 1515 evidenziano un volontario arcaismo, le cui rappresentazioni in rilievo sono tratte dal Ghiberti (Firenze, 1378 – Firenze, 1455), ma integrate da una reale paesistica che richiama la pittura fiamminga del Quattrocento. Questo procedere in controtendenza agli sviluppi della pittura rinascimentale portò l'Albertinelli al desiderio di alterarne le forme. Tuttavia, nella "Madonna col Bambino, i santi Paolo, Michele, Apollonia, Pietro e il donatore" di Rignano sull'Arno, datata 1514, si evidenziano nuovamente la struttura compositiva e la coloristica del vecchio collega.

Sempre dal Vasari si ricava che Mariotto, nel luglio 1515, si recò a Viterbo per la realizzazione di una tavola, che non fu portata a termine. In verità fu il suo ex collaboratore, proprio in quel periodo, ed in quella città (esattamente nel Convento della Quercia), ad iniziare la pala dell'Incoronazione di Maria lasciandola incompiuta. Il convento, volendo farla completare, affidò l'incarico all'Albertinelli, proprio per la vicinanza stilistica dei due pittori. Neanche quest'ultimo, per impegni che egli stesso riteneva superiori – dovette recarsi a Roma, per la realizzazione, nella chiesa di San Silvestro al Quirinale, di un "Matrimonio mistico di santa Caterina", andato poi perduto (citato nelle Guida di Roma di Filippo Titi del 1763 e di Angelo Pellegrini del 1869) – non riuscì a portare a termine la tavola, che fu completata – nel 1545 – da fra Paolino da Pistoia, allievo della Scuola di S. Marco.

Rientrato a Viterbo "dove aveva alcuni amori, ai quali, per lo desiderio del non gli avere posseduti, mentre che stette a Roma, volse mostrare ch'era ne la giostra valente, per che fece l'ultimo sforzo; e come quel che non era né molto giovane né valoroso in così fatte imprese, fu sforzato mettersi nel letto. Di che, dando la colpa all'aria di quel luogo, si fé portare a Fiorenza in ceste. E non gli valsero aiuti né ristori, che di quel male si morì in pochi giorni d'età d'anni 45, et in San Pier Maggiore di quella città fu sepolto."

Ebbe come allievi Francesco di Cristofano   (il Franciabigio), Jacopo Carrucci (il Pontormo),  Innocenzo da Imola e Giuliano Bugiardini.