LQuesto cartone, cui non si sa bene che fine abbia fatto, rappresentava i soggetti modificati in uno sviluppo di passaggio dal primo (quello a carboncino, biacca e tenui colori presentato nella pagina precedente) alla tavola in esame. All'Accademia di Venezia è custodito il disegno di cui ne parlò Heydenreich intorno al 1500, Popham nel 1498-99 e Pietro Novellara in una lettera indirizzata alla marchesa di Mantova, che riporta il seguente scritto: "... [Leonardo] pinge un Cristo bambino di età circa uno anno, che uscendo quasi de bracci ad la mamma piglia uno agnello et pare che lo stringa. La mamma quasi levandosi de grembo ad S. Anna, piglia il bambino per spiccarlo dallo agnellino. S. Anna, alquanto levandose da sedere pare che voglia ritenere la figliola che non spicca il bambino dallo agnellino''.  Anche l'Anonimo Gaddiano parlando di Leonardo fa riferimento allo stesso cartone: " ...... fece disegni, cose meravigliose, e infra gli altri una Nostra Donna e una S. Anna che andò in Francia". Il Vasari, nonostante non avesse visto con i propri occhi né il cartone né l'opera pittorica sulla tavola, lo descrive con enfasi precisando: 'In questo mezo [parlando del del periodo di soggiorno presso i Serviti, all'Annunziata, come scritto nell'edizione' del 1550, e non "finalmente", come riportato nel testo del 1568] fece un cartone dentrovi una nostra Dona e una S. Anna con un Cristo, la quale non pure fece meravigliare tutti gli artefici, ma finita che ella fu, nella stanza durarono duoi giorni di andare a vederla gli uomini e le donne, i giovani e i vecchi, come si va alle feste solenni, per vedere le meraviglie di Leonardo che fecero stupire tutto quel popolo". Il Vasari prosegue quindi nella descrizione riferendosi anche a un San Giovannino ("un San Giovanni piccol fanciullo che si andava trastullando con un pecorino") collocato ai piedi della Vergine, aprendo così l'ipotesi dell'esistenza di un terzo cartone preparatorio, anche questo andato perduto. Ma proprio su questo cartone interviene il Berenson elencando disegni di particolari ne testimoniano l'esistenza: