Della sua formazione artistica si conosce ben poco, ma dalle sue opere giovanili risulta abbastanza evidente l’influenza di Giovanni Bellini. Ciò nonostante pare che abbia frequentato la bottega d’arte dei Vivarini. Nel periodo 1503-1506, si trova ad operare a Treviso (così risulta da alcuni documenti), dove probabilmente vi soggiorna già da qualche tempo e, anche grazie alla conoscenza del vescovo Bernardo de Rossi, riesce a lavorare intensamente su svariate tematiche che diventeranno le peculiarità del suo programma futuro: ritratti, pale d’altare e moltissime immagini a sfondo religioso.

Nel 1506 si reca per un soggiorno nelle Marche per adempiere alla richiesta della realizzazione di un polittico per la chiesa di San Domenico a Recanati. Qualche anno più tardi, nel 1508, si trova a Roma per la decorazione degli appartamenti papali in città del Vaticano, lavoro che non viene però apprezzato da papa Giulio II. Accusando il colpo, nel 1510, ritorna a Recanati e lavora all’affresco di “S. Vincenzo Ferreri in gloria” ed alla pala della “Trasfigurazione” per la chiesa di S. Domenico, nonché ad una “Deposizione” ad Jesi per la chiesa di S. Floriano. Nel 1513 esegue una grande pala a Bergamo per la chiesa di S. Stefano (attualmente in S. Bartolomeo).

Negli anni 1523-24 realizza la decorazione delle tarsie per il coro di S. Maria Maggiore, del quale Lotto si assume l’impegno di fornire anche i modelli, eseguiti in seguito da G. F. Capoferri. Gli anni successivi lo trovano impegnato in varie zone del centro Italia, conosciute soltanto in parte e pochissimo documentate: altri riferimenti inequivocabili dei suoi spostamenti provengono dalle numerosissime pale sparse per le chiese marchigiane, tra cui anche quelle di Recanati ed Jesi, dalle quali in più occasioni viene chiaramente segnalata la sua presenza. Molto meglio documentata risulta essere la sua vita dopo il 1540, anno in cui l’artista ha iniziato a trascrivere le varie spese in un libro, chiamato appunto “Libro di spese diverse”, che è arrivato ai nostri tempi, dove tiene conto di qualsiasi evento relativo alla sua vita artistica ma anche privata. Da qui si rilevano anche i suoi rapporti di sincera amicizia con Sansovino e Serio, nonché le problematiche relative alla sua difficile situazione finanziaria e alle tante altre sfaccettature della vita quotidianamente vissuta. Nel 1540 ritorna a Venezia e si dedica alla realizzazione della pala per S. Giovanni e Paolo, portata a termine nel 1542.  Sempre nello stesso anno, ad ottobre, Lotto parte per un soggiorno a Treviso per poi rientrare a Venezia nel 1545. Nel 1549 si deve spostare di nuovo, questa volta ad Ancona, per realizzare la pala al S. Francesco alle scale. Nonostante la sua indiscutibile capacità artistica , Lorenzo Lotto, paga duramente la sua posizione libera ed indipendente nel mondo artistico del suo periodo: la prosperità non gli è mai arrivata e, intorno al 1550, per procurarsi sostentamento è costretto a separarsi, con una precaria ed improvvisata vendita all’asta, da quarantasei sue opere. Nonostante questa dolorosa vendita le sue finanze rimangono precarie, quindi deve vendere altri oggetti e poi entrare in una comunità religiosa di Loreto. Le sue ultime trascrizioni risalgono al 1556 e la prima documentazione che lo trova già defunto è del 9 luglio 1557.